청둥오리의 재미있는 생명공학-3

청둥오리의 재미있는 생명공학 이야기-3

안녕하세요! 오늘은 생명공학 이야기 3번째 시간입니다. 오늘은 DNA를 이용해 단백질의 기능을 확인하는 방법에 대해서 다룰 것입니다. 그럼 시작해보도록 할까요?

DNA 도서관

DNA도서관은 특정 생명체의 DNA 클론을 모아놓은 것을 의미합니다. DNA도서관 중 가장 규모가 큰 것은 유전자 도서관입니다. 유전자 도서관은 한 생명체의 유전자 전체를 클로닝 한 것입니다. 유전자 도서관을 만들기 위해서는 첫번째 이야기에서 언급한 DNA클로닝 과정을 거칩니다. 우선 DNA를 제한효소를 이용해 수천 개의 조각으로 쪼개고, YAC혹은 BAC와 같은 벡터들도 같은 제한효소로 잘라줍니다. 그리고 이들을 연결효소로 연결한 후, 호스트에 넣고 선별하는 과정을 거쳐 도서관을 완성하게 됩니다. 하지만, 모든 DNA가 단백질에 대한 정보를 담고 있는 것이 아닙니다. 그러면 단백질을 암호하는 DNA만을 도서관으로 만들려면 어떻게 해야 할까요? 바로 mRNA를 이용하는 것입니다. mRNA를 이용해서 역으로 DNA을 합성하는 것입니다. 이 것을 가능케 하는 효소가 역전사효소입니다. 아래의 그림과 같은 과정을 거쳐서 DNA를 합성할 수 있게 됩니다. 역전사 과정을 통해 얻은 DNA를 cDNA라고 부릅니다. 이렇게 만들어진 도서관을 분석한다면 발현되는 단백질에 대해서 집중적으로 연구를 할 수 있습니다.

<그림1> mRNA를 이용한 cDNA합성

Fusion 단백질과 면역형광법

단백질의 기능을 파악하는 데 중요한 요소 중 하나는 단백질이 발현되는 위치를 알아내는 것입니다. 위치를 알아내는 방법 중 하나는 마커를 합친 fusion 단백질을 사용하는 것입니다. 마커는 보통 형광물질을 통해서 시각적으로 단백질의 위치를 확인할 수 있게 해줍니다. 대표적인 예시로는 초록색 형광 단백질인 GFP가 있습니다. 우리가 확인하는 싶은 단백질을 암호화하는 유전자와 GFP유전자를 합친 뒤, 푸른색의 빛을 비추면 유전자로부터 전사, 번역 된 단백질이 초록색을 띠게 됩니다.
또 다른 방법으로는 면역형광법을 이용하는 것입니다. 이 방법은 세포 고정이 필요합니다. 즉, 살아있는 세포에 사용할 수 없는 방법입니다. 우리가 위치를 알고자하는 단백질을 항원결정인자이라는 것에 붙입니다. 항원결정인자는 작은 단백질로, 우리가 흔히 구할 수 있는 항체와 강한 결합을 이루고 있습니다. 이 항체에는 형광색소(fluorochrome)가 있는 2차 항체가 결합해 있습니다. 이 방법을 응용한 방법으로는 첫 번째 항체에 바이오틴분자들을 붙이고, 그 다음으로는 스트렙타아비딘와 형광색소의 복합체를 추가해주는 것입니다. 바이오틴과 스트렙타아비딘 간의 상호작용은 매우 강한 상호작용이기 때문에 이 방법은 매우 효과적으로 단백질의 위치를 파악할 수 있습니다.

<그림2>타겟 단백질, 1,2차 항체 모형

단백질-단백질 상호작용을 통한 단백질 기능 파악하기

1. 면역침전반응(Immunoprecipitation)

이 방법은 앞에서 설명한 방법을 응용한 방법입니다. 우리가 밝히고자 하는 단백질의 유전자와 항원결정인자의 유전자를 합칩니다. 그 다음, 세포 추출물을 얻은 후, 특정한 항체 처리를 해줍니다. 합친 유전자로부터 생성된 단백질은 특정한 항체와 결합을 통해 침전물을 이루게 되고, 이때 우리가 원하는 단백질과 결합하는 다른 단백질들도 함께 침전물을 이루게 됩니다. 이렇게 얻은 단백질 침전물을 분리하고 분석을 하게 되면 우리가 관심있는 단백질과 상호작용하는 다른 단백질들을 알 수 있게 되고, 이를 통해서 기능을 유추할 수 있습니다.

2. 탄뎀 친화도 정화 단백질(Tandem Affinity Purification tags)

위의 방법을 응용한 기법으로, 크로마토그래피와 유사한 기법이라고 볼 수 있습니다. 이 기법의 특징은 하나의 항원결정인자가 아닌 2개의 항원결정인자를 원하는 단백질에 부착하는 것입니다. 예를 들어, 첫번째 항원결정인자는 특정 박테리아 표면에서 발견되는 단백질 A, 다른 하나는 칼모듈린-결합 펩타이드입니다. 단백질 A는 동물세포에서 발견되는 IgG라는 단백질과 강한 결합을 이룰 수 있습니다.

<그림3>탄뎀 친화도 정화 단백질(Tandem Affinity Purification tags)

3. 효모 단백질 잡종법(Yeast Two-Hybrid) 분석

이 방법은 Gal4p라는 단백질이 중요한 역할을 합니다. Gal4p라는 단백질은 GAL이라는 유전자의 전사를 활성화하는 역할을 합니다. Gal4p는 두 개의 도메인을 갖고 있습니다. 하나는 DNA와 결합, 다른 하나는 RNA중합효소를 활성화합니다. 전사를 하기 위해서는 이 도메인들이 서로 하나로 합쳐져야 합니다. 효모 단백질 잡종법은 GAL에 의한 유전자 전사 유무를 이용해 단백질 간의 상호작용을 확인합니다. 먼저 하나의 효모 군집에는 Gal4p단백질의 DNA결합 도메인에 X라는 단백질을 결합시킵니다. 또 하나의 효모군집에는 Gal4p단백질의 도메인에 Y라는 단백질을 결합시킵니다. 이 두개의 효모 군집의 교배를 통해서 만들어진 효모 군집은 X, Y가 포함된 도메인 두개를 모두 갖게 됩니다. 그리고 이 효모 군집을 GAL유전자 전사로부터 생성된 단백질이 있어야만 생존할 수 환경의 배지에서 기릅니다. 만약에, X와 Y가 서로 결합을 한다면, 두 개의 도메인 합쳐져 유전자 전사가 가능해져 생존이 가능합니다. 그 반대의 경우에는 효모가 생존할 수 없게 되겠지요. 이를 통해서 X와 Y가 서로 어떠한 상호작용을 하는 지 확인할 수 있습니다.

<그림4> Gal4p와 유전자의 결합

용어정리

• 바이오틴: 비타민 B₇ 로, 생명체에서 다양한 반응에 관여한다.
• 스트렙타아비딘: 박테리아에서 발견되는 단백질로, 바이오틴과 강력히 결합한다.
• 도메인: 독립적으로도 안정하여 고유의 기능과 이동이 가능한 폴리펩타이드이다. 긴 폴리펩타이드는 여러개의 도메인을 가질 수 있다.

참고문헌

Nelson; Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th edition, W.H. Freeman. 2017. 335-342

오늘은 이렇게 단백질의 기능을 확인하는 여러가지 방법에 대해 알아보았습니다. 다음 시간에는 유전자 가위인 CRISPR에 대해서 알아보도록 하겠습니다. 다음 이야기에서 만나요!